2019-04-28
荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。
荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发平均停留的时间，处于激发态的荧光分子在从激发到基态的过程中发射荧光释放能量。荧光寿命成像可以区分荧光物质浓度和淬灭效应的影响，这使得荧光寿命成像显微学成为一个有力的工具进行细胞内的定量环境和分子动力学分析。
一、频域FLIM使用正选调制的激光器或者发光二极管LED作为光源对样品进行激发，样品会产生与激发光同频率但相位差为△Φ的荧光信号然后使用同频率调制的CCD或者PMT作为探测器解调并接收荧光信号，通过测量解调系数M，即可计算相应的荧光寿命τc和τm。
国际上对频域FLIM的研究开展较早。如何提高成像速率成为频域FLIM技术首先需要解决的问题。
二、时域FLIM通过脉冲激光器激发荧光团，利用探测器等直接探测荧光衰减信号成像。
时域设备与频域相比，通常有更快的成像速度和更高的时间分辨率，因此对设备要求更高。TCSPC有理想的光子计数率和超高的时间分辨率，与门控探测相比，可测量更短的荧光寿命。门控法的荧光寿命分辨率虽不及TCSPC，但图像获取速度通常很快，是实现非稳态过程探测的有力技术手段。
某一段时间内检测到发射光子的概率与此时段内的荧光强度成正比，通过测量探测荧光强度的衰减即可实现荧光寿命的探测。TCSPC基于上述原理实现，构造出如右图荧光发射光子在时间轴上的概率分布曲线，即荧光衰减曲线。由于每个周期只记录一个光子，成像速度慢成为TCSPC最大缺点。TCSPC的时间分辨率很高，通常只受探测器渡越时间限制。
三、宽场FLIM是宽视场的荧光寿命成像显微镜，右图给出了宽场显微镜与扫描显微镜的对比。宽场FLIM优势在于较弱的荧光团光漂白效应和较快的系统成像速度，相同探测率下，所需要的激发光要小的多，则样品受到光漂白的影响会小于扫描系统。宽场系统缺点在于其成像深度小与扫描系统，无法得到样本深层的图像。这可通过其他手段得到改善。
组成部分 | 类别 | 用途 |
条纹管 快速扫描电极 输入和输出装置 | 飞秒条纹相机 大动态范围条纹相机 帧条纹相机 X-射线条纹相机等 | 测量超快荧光 |
工作原理： 由超短光脉冲诱导的、从样品发出的荧光被聚焦在条纹相机的光阴电极上，从光阴电极上释放的光电子流量与聚焦在光阴电极上的荧光强度成比，这些电子在加速电场中被加速，然后在偏转电场中被偏离，最后入射到荧光屏的磷光粉上。 因此，在不同的时刻，从光阴电极上释放出来的光电子入射到荧光屏上位置也不同。这样在荧光屏上就可以看到一条条轨迹或者称之为条纹，这些条纹的空间分辨率直接对应于荧光的时间分辨率。 | ||
PCO.FLIM相机系统，是第一种采用Two-Tap CMOS成像芯片的荧光寿命成像相机。相机既能够在内部产生宽广的频率信号，也可接收一定频率范围内的外部调制信号。此相机具有多种触发输入和信号输出模式，便于系统集成。
其特殊的软件能直接进行测量以及寿命数据分析，可应用于：荧光寿命成像（FLIM）；磷光寿命成像（PLIM）；基于FLIM的PRET测量，压敏涂料（PSP）；温敏涂料（TSP）；光化学感应等。
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